Навіны - Маніторынг узроўню растворанага кіслароду ў працэсе біяфармацэўтычнай ферментацыі

Што такое раствораны кісларод?

Раствораны кісларод (РК) адносіцца да малекулярнага кіслароду (O_₂), які раствараецца ў вадзе. Ён адрозніваецца ад атамаў кіслароду, якія прысутнічаюць у малекулах вады (H_₂O), бо ён існуе ў вадзе ў выглядзе незалежных малекул кіслароду, якія паступаюць з атмасферы або ўтвараюцца ў выніку фотасінтэзу воднымі раслінамі. На канцэнтрацыю растворанага кіслароду ўплываюць розныя фактары, у тым ліку тэмпература, салёнасць, паток вады і біялагічная актыўнасць. Такім чынам, яна служыць крытычна важным паказчыкам для ацэнкі стану здароўя і забруджвання воднага асяроддзя.

Раствораны кісларод адыгрывае жыццёва важную ролю ў стымуляванні мікробнага метабалізму, уплыве на клетачнае дыханне, рост і біясінтэз прадуктаў метабалізму. Аднак больш высокі ўзровень растворанага кіслароду не заўсёды карысны. Лішак кіслароду можа прывесці да далейшага метабалізму назапашаных прадуктаў і патэнцыйна выклікаць таксічныя рэакцыі. Аптымальныя ўзроўні растворанага кіслароду адрозніваюцца ў розных відаў бактэрый. Напрыклад, падчас біясінтэзу пеніцыліну раствораны кісларод звычайна падтрымліваецца на ўзроўні прыблізна 30% насычэння паветра. Калі раствораны кісларод падае да нуля і застаецца на гэтым узроўні на працягу пяці хвілін, утварэнне прадукту можа быць значна парушана. Калі гэты стан захоўваецца на працягу 20 хвілін, могуць узнікнуць незваротныя пашкоджанні.

У цяперашні час найбольш распаўсюджаныя датчыкі растворанага кіслароду могуць вымяраць толькі адноснае насычэнне паветрам, а не абсалютную канцэнтрацыю растворанага кіслароду. Пасля стэрылізацыі культуральнага асяроддзя праводзіцца аэрацыя і перамешванне, пакуль паказанні датчыка не стабілізуюцца, пасля чаго значэнне ўстанаўліваецца на 100% насычэння паветрам. Наступныя вымярэнні падчас працэсу ферментацыі заснаваныя на гэтай спасылцы. Абсалютныя значэнні растворанага кіслароду нельга вызначыць з дапамогай стандартных датчыкаў і патрабуюць больш складаных метадаў, такіх як паляраграфія. Аднак вымярэнняў насычэння паветрам звычайна дастаткова для маніторынгу і кантролю працэсаў ферментацыі.

У ферментары ўзровень растворанага кіслотнага раствора можа адрознівацца ў розных рэгіёнах. Нават калі ў адзін момант атрымліваецца стабільны паказчык, у некаторых культуральных асяроддзях усё яшчэ могуць назірацца ваганні. У больш буйных ферментарах назіраюцца большыя прасторавыя варыяцыі ўзроўню растворанага кіслотнага раствора, што можа істотна паўплываць на рост і прадукцыйнасць мікробаў. Эксперыментальныя дадзеныя паказалі, што, хоць сярэдні ўзровень растворанага кіслотнага раствора можа складаць 30%, прадукцыйнасць ферментацыі ў зменлівых умовах значна ніжэйшая, чым у стабільных. Такім чынам, пры павелічэнні маштабу ферментатараў, акрамя меркаванняў геаметрычнага і магутнаснага падабенства, мінімізацыя прасторавых варыяцый растворанага кіслотнага раствора застаецца ключавой мэтай даследавання.

Чаму маніторынг растворанага кіслароду важны ў біяфармацэўтычнай ферментацыі?

1. Падтрымліваць аптымальнае асяроддзе росту мікраарганізмаў або клетак
Прамысловая ферментацыя звычайна ўключае аэробныя мікраарганізмы, такія як кішачная палачка і дрожджы, або клеткі млекакормячых, такія як клеткі яечнікаў кітайскага хамячка (CHO). Гэтыя клеткі функцыянуюць як «рабочыя» ў сістэме ферментацыі, патрабуючы кіслароду для дыхання і метабалічнай актыўнасці. Кісларод служыць тэрмінальным акцэптарам электронаў у аэробным дыханні, што дазваляе выпрацоўваць энергію ў выглядзе АТФ. Недастатковае паступленне кіслароду можа прывесці да ўдушша клетак, прыпынку росту або нават гібелі клетак, што ў канчатковым выніку прывядзе да няўдачы ферментацыі. Маніторынг узроўняў растворанага кіслароду гарантуе, што канцэнтрацыя кіслароду застанецца ў аптымальным дыяпазоне для ўстойлівага росту і жыццяздольнасці клетак.

2. Забяспечыць эфектыўны сінтэз мэтавых прадуктаў
Мэта біяфармацэўтычнай ферментацыі — не толькі стымуляваць праліферацыю клетак, але і садзейнічаць эфектыўнаму сінтэзу патрэбных мэтавых прадуктаў, такіх як інсулін, моноклональные антыцелы, вакцыны і ферменты. Гэтыя біясінтэтычныя шляхі часта патрабуюць значных энергетычных выдаткаў, у асноўным атрыманых з аэробнага дыхання. Акрамя таго, многія ферментатыўныя сістэмы, якія ўдзельнічаюць у сінтэзе прадуктаў, непасрэдна залежаць ад кіслароду. Дэфіцыт кіслароду можа парушыць або знізіць эфектыўнасць гэтых шляхоў.

Больш за тое, узровень растворанага кіслотнага раствора дзейнічае як рэгуляторны сігнал. Як празмерна высокія, так і празмерна нізкія канцэнтрацыі растворанага кіслотнага раствора могуць:
— Змяняць клеткавыя метабалічныя шляхі, напрыклад, пераходзячы ад аэробнага дыхання да менш эфектыўнай анаэробнай ферментацыі.
- Выклікаюць клеткавыя стрэсавыя рэакцыі, што прыводзіць да выпрацоўкі непажаданых пабочных прадуктаў.
- Уплываюць на ўзровень экспрэсіі экзагенных бялкоў.

Дакладна кантралюючы ўзровень растворанага кіслот на розных этапах ферментацыі, можна накіраваць клеткавы метабалізм у бок максімальнага сінтэзу мэтавага прадукту, тым самым дасягаючы ферментацыі з высокай шчыльнасцю і высокім выхадам.

Уводзіны ў схему патоку вады для біяфармацэўтычных прэпаратаў

3. Для прадухілення дэфіцыту або лішку кіслароду
Гіпаксія (дэфіцыт кіслароду) можа мець сур'ёзныя наступствы:
- Спыняецца рост клетак і сінтэз прадуктаў.
- Метабалізм пераходзіць у анаэробны бок, што прыводзіць да назапашвання арганічных кіслот, такіх як малочная і воцатная, якія зніжаюць pH культуральнага асяроддзя і могуць атруціць клеткі.
— Працяглая гіпаксія можа прывесці да незваротных пашкоджанняў, прычым аднаўленне будзе няпоўным нават пасля аднаўлення падачы кіслароду.

Лішак кіслароду (перасычэнне) таксама стварае рызыкі:
- Гэта можа выклікаць акісляльны стрэс і ўтварэнне актыўных формаў кіслароду (АФК), якія пашкоджваюць клеткавыя мембраны і біямалекулы.
- Празмерная аэрацыя і перамешванне павялічваюць спажыванне энергіі і эксплуатацыйныя выдаткі, што прыводзіць да непатрэбнай страты рэсурсаў.

4. Як крытычны параметр для маніторынгу ў рэжыме рэальнага часу і кіравання з зваротнай сувяззю

Раствораны кісларод (РА) — гэта параметр у рэжыме рэальнага часу, які бесперапынна і комплексна адлюстроўвае ўнутраныя ўмовы сістэмы ферментацыі. Змены ўзроўню РА могуць адчувальна паказваць розныя фізіялагічныя і аперацыйныя станы:
- Хуткі рост клетак павялічвае спажыванне кіслароду, што прыводзіць да зніжэння ўзроўню растворанага кіслороду.
- Знясіленне або інгібіраванне субстрата запавольвае метабалізм, зніжаючы спажыванне кіслароду і выклікаючы павышэнне ўзроўню растворанага кіслороду.
- Забруджванне іншароднымі мікраарганізмамі змяняе характар спажывання кіслароду, што прыводзіць да анамальных ваганняў растворанага кіслароду і служыць раннім сігналам папярэджання.
- Няспраўнасці абсталявання, такія як адмова мяшалкі, закаркаванне вентыляцыйнай трубы або забруджванне фільтра, таксама могуць прывесці да анамальных паводзін растворанага кіслотнага раствора.

Інтэграцыя маніторынгу растворанага кіслот у рэжыме рэальнага часу ў аўтаматызаваную сістэму кіравання з зваротнай сувяззю дазваляе дасягнуць дакладнага рэгулявання ўзроўняў растворанага кіслот за кошт дынамічнай карэкціроўкі наступных параметраў:
- Хуткасць перамешвання: Павелічэнне хуткасці паляпшае кантакт газу і вадкасці, разбураючы бурбалкі, тым самым паляпшаючы эфектыўнасць перадачы кіслароду. Гэта найбольш распаўсюджаны і эфектыўны метад.
- Хуткасць аэрацыі: рэгуляванне хуткасці патоку або складу ўваходнага газу (напрыклад, павелічэнне долі паветра або чыстага кіслароду).
- Ціск у балоне: Павышэнне ціску павялічвае парцыяльны ціск кіслароду, тым самым павялічваючы растваральнасць.
- Тэмпература: паніжэнне тэмпературы павялічвае растваральнасць кіслароду ў культуральным асяроддзі.

Рэкамендацыі BOQU па прадуктах для анлайн-маніторынгу біялагічнай ферментацыі: